O presente trabalho teve como objetivo reportar a ocorrência de Borrelia spp. em culturas de células embrionárias de Boophilus microplus infectados naturalmente. Sete dias após o início de uma nova cultura primária de células embrionárias do carrapato B. microplus, incubadas a 31ºC, notou-se que as células começaram a degenerar. Ao exame em microscópio de contraste de fase detectou-se a presença de microrganismos alongado e com grande mobilidade. Lâminas de microscópio confeccionadas com amostras do sobrenadante da cultura, hemolinfa e massa de ovos, coradas pelo May Grünwald-Giemsa, permitiram a visualização de espiroquetas. O exame morfológico do microrganismo e sua visualização em B. microplus sugere ser Borrelia spp.

The aim of the present work was to report the occurrence of Borrelia spp. in embryonic cell cultures from naturally infected Boophilus microplus. Seven days after the beginning of a primary culture of embryonic cells of B. microplus at 31ºC was noted that the cells start suffering degeneration. Under examination at phase contrast microscope, the presence of prolongated microorganisms with great mobility was detected. Microscopic slides of the culture supernatant, hemolymph and egg mass, were stained by May Grünwald-Giemsa, allowing the visualization of the spirochetes. The morphologic examination of the microorganism and its visualization in. B. microplus, suggest to be Borrelia spp.

Surtos de Trypanosoma vivax em bovinos de corte do Pantanal foram responsáveis por relevante impacto econômico, devido a perda de peso, abortos e mortalidade. Um manejo comum é o deslocamento de bovinos do Pantanal baixo para áreas adjacentes desse ecosistema para reprodução e engorda. Por essa razão, foi efetuado um estudo epidemiológico em rebanho de vacas movidas para uma área de transição entre Pantanal baixo e planalto do Estado de Mato Grosso do Sul para determinar a dinâmica de infecção do T. vivax e o risco de surto. Três grupos experimentais foram formados: Grupo 1; composto por vacas parasitologicamente negativas no teste de Woo e no exame sorológico de imunoadsorção enzimática para detecção de anticorpos contra T. vivax (Tv-ELISA-Ab); Grupo 2, vacas negativas parasitológicamente e com reação positiva no Tv-ELISA-Ab; e no Grupo 3, positivas parasitologicamente e no Tv-ELISA-Ab. Durante 24 meses o deslocamento das vacas entre esses grupos experimentais foi determinado pelo monitoramento mensal realizado pelo teste de Woo e Tv-ELISA-Ab. Durante esse período a população de tabanídeos na área experimental foi determinada e as maiores populações ocorreram no período das chuvas. Parasitemias de T. vivax foram detectadas apenas nas quatro primeiras amostragens do período experimental, apesar da elevação de incidência determinada sorológicamente tenha ocorrido no período seco do ano. Portanto, T. vivax foi endêmico no rebanho e a ausência de manifestação clínica sugere que os bovinos sejam tripanotolerantes e o risco de surto seja nulo nas condições em que o experimento foi executado, pois a manifestação clínica da doença esta associada à presença de parasitemia.

Trypanosoma vivax outbreaks in beef cattle in the Pantanal region of Mato Grosso do Sul state, Brazil, causes relevant economical impact due to weight loss, abortion and mortality. Cattle moved from the Pantanal to adjacent areas of this ecosystem for breeding and fattening is a common feature. Therefore an epidemiological study on breeding cows in the transition area between Pantanal lowland and adjacent highlands of Mato Grosso do Sul was performed to determine the T. vivax infection dynamics and outbreak risk. Three experimental groups were formed: Group 1 consisted of cows parasitologically negative by the Woo test and in the enzyme-linked immunosorbent assay for T. vivax antibody detection (Tv-ELISA-Ab); Group 2 parasitologically negative and positive in the Tv-ELISA-Ab; and in Group 3 cows were parasitologically positive and with positive reactions in the Tv-ELISA-Ab. During 24 months, the cows' dislodgment between the above established groups was monitored by Woo test and Tv-ELISA-Ab exams. The tabanid population was also monitored and the highest number occurred during the rainy season. Although parasitemias were detected only in the first four samplings of the experimental period, the cows could be considered as trypanotolerant, because no clinical signs were observed. Despite the higher T. vivax incidence during the dry season, no disease symptoms were seen. Even though T. vivax epidemiological situation in the herd was characterized as endemic with seasonal variation, the probability of outbreaks was null within the conditions of the study.

Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on recombinant major surface protein 5 (rMSP5) and initial body (IB) antigens from a Brazilian isolate of Anaplasma marginale were developed to detect antibodies against this rickettsia in cattle. Both tests showed the same sensitivity (98.2%) and specificities (100% for rMSP5 and 93.8% for IB ELISA) which did not differ statistically. No cross-reactions were detected with Babesia bigemina antibodies, but 5 (rMSP5 ELISA) to 15% (IB ELISA) of cross-reactions were detected with B. bovis antibodies. However, such difference was not statistically significant. Prevalences of seropositive crossbred beef cattle raised extensively in Miranda county, state of Mato Grosso do Sul, Brazil, were 78.1% by rMSP5 ELISA and 79.7% by IB ELISA. In the analysis of sera from dairy calves naturally-infected with A. marginale, the dynamics of antibody production was very similar between both tests, with maternal antibodies reaching the lowest levels at 15-30 days, followed by an increase in the mean optical densities in both ELISAs, suggesting the development of active immunity against A. marginale. Results showed that all calves were seropositive by one-year old, characterizing a situation of enzootic stability. The similar performances of the ELISAs suggest that both tests can be used in epidemiological surveys for detection of antibodies to A. marginale in cattle.

Indirect enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) based on recombinant MSP1a and MSP2 from a Brazilian isolate of Anaplasma marginale were developed to detect antibodies against this rickettsia in cattle. The high sensitivities (99% for both tests) and specificities (100% for both tests) were confirmed with sera from cattle positive or negative for A. marginale antibodies, respectively, by immunofluorescent antibody test. By the analysis of 583 sera from cattle of three regions of the state of Pernambuco, Brazil, the agreement between both tests was high, with a kappa index of 0.89. The similar performances of the ELISAs suggest that both tests can be used in epidemiological surveys for detection of antibodies to A. marginale in cattle.

The objectives of this work were to determine the prevalence of Babesia bovis, Babesia bigemina, and Anaplasma marginale detecting antibodies in cattle raised in the semi-arid region of the state of Bahia, Brazil, through indirect enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) and to compare the performances of indirect enzyme-linked immunosorbent assays with crude (I-ELISA-CrAnaAg) and recombinant major surface protein-5 (I-ELISA-MSP-5Ag), as antigens to detect antibodies against A. marginale. An stable enzootic area was found in Senhor do Bonfim and Euclides da Cunha for B. bovis that showed 86 and 95.5% of prevalence, respectively, and for B. bigemina with 90.8 and 91.3%. On the other hand, Uauá and Juazeiro, were characterized as enzootically unstable areas, since prevalences were: B. bovis - 63.7 and 56.4% and B. bigemina - 53 and 54.8%, respectively. The prevalence of A. marginale in the four municipalities was above 97% with I-ELISA-CrAnaAg and 94.8% with I-ELISA-MSP-5Ag which is an indication of stable enzootic condition for the rickettsia. The I-ELISA-CrAnaAg and I-ELISA-MSP-5Ag showed a highly significant association (r = 0.977), which means that both ELISA tests are suitable for epidemiological studies of A. marginale.

Até o presente momento, as imunizações contra anaplasmose em rebanhos bovinos utilizam organismos vivos ou mortos. No entanto, esforços têm sido realizados nos últimos anos com o objetivo de desenvolver uma nova geração de vacinas. A membrana externa de Anaplasma marginale é capaz de induzir reposta imune protetora contra desafio homólogo e parcialmente protetora contra desafio heterólo-go. Nela foram identificadas seis proteínas principais de superfície (MSPs), as quais têm sido alvo de estudos para o desenvolvimento de imunógenos contra a anaplasmose. Destas proteínas, MSP1a e MSP2 têm demonstrado maior potencial como imunógenos, protegendo os animais contra desafio com isolados virulentos homólogos e heterólogos de A. marginale, apesar do polimorfismo de tamanho da primeira proteína e variabilidade do gene que codifica a segunda. Uma outra alternativa para a imunização contra A. marginale é o cultivo in vitro dessa riquétsia. Organismos inativados provenientes de cultivo em células IDE8 de Dermacentor variabilis foram testados como imunógeno. Os animais apresentaram uma significativa diferença na redução do volume globular após desafio e não apresentaram sinais clínicos de anaplasmose. Além da proteção conferida por este tipo de imunógeno, os organismos provenientes de cultura de células de carrapato são livres de células e patógenos de bovinos, o que é uma vantagem significativa quando comparado aos processos tradicionais de imunização.

The current immunization against anaplasmosis in cattle is derived from the blood of infected animals, as live or dead organisms. Nevertheless, efforts have been made to develop a new generation of vaccines. The outer membrane of Anaplasma marginale induces a protective immune response against challenge with homologous isolates and a partially protective response against heterologous challenge. In this membrane, six major surface proteins (MSPs) have been identified, which have been targeted for the development of immunogens against anaplasmosis. From those proteins, MSP1a and MSP2 have shown the greatest potential as immunogens, protecting cattle against challenge with virulent homologous and heterologous isolates of A. marginale, despite the size polymorphism of the former protein and the variability of the gene that encodes the latter protein. Another alternative of immunogen is the in vitro culture of A. marginale. Inactivated organisms originating from Dermacentor variabilis IDE8 cell culture were tested as immunogen. Cattle immunized with cell culture-derived A. marginale had a significantly lower reduction in the packed cell volume after challenge exposure and did not display clinical anaplasmosis. Besides the protection afforded by this type of immunogen, cell culture derived organisms are free from bovine cells and pathogens, what is a major advantage as compared with traditional immunization procedures.

Antigenic characterization of Anaplasma marginale isolates, by identifying conserved and variable epitopes of major surface proteins (MSP), is an important tool for vaccine development against this rickettsia. The B cell epitopes of A. marginale isolates from three microregions of the State of Pernambuco and one from the State of Mato Grosso do Sul, Brazil, were characterized by indirect fluorescent antibody technique (IFAT) and Western blot (WB) with 15 monoclonal antibodies (MAbs). The epitope recognized by MAb ANA22B1 (MSP-1a) was conserved by IFAT and WB (73-81 kDa). MSP-2 epitopes recognized by MAbs ANAO58A2 and ANAO70A2 were conserved by IFAT, while ANAO50A2 and ANA66A2 epitopes were polymorphic; in the WB, the MAbs ANAO50A2 and ANAO70A2 identified bands of 45 kDa only in the Pernambuco-Mata isolate. None of the isolates reacted with MAb ANAR75C2 (MSP-3). The MSP-4 epitope recognized by MAb ANAR76A1 was conserved by IFAT, as well as the MSP-5 epitope recognized by MAb ANAF16C1 by IFAT and WB (16 kDa). The MAbs ANAR17A6, ANAR83B3, ANAR94C1, ANAO24D5 and ANAR19A6 identified conserved epitopes by IFAT. MSP-1, MSP-2 and MSP-4, which previously showed partial protection in experimental trials, are also potential immunogens to be employed in Brazil, due to the B cell epitope conservation.

Um estudo de epidemiologia molecular foi executado com isolados de Babesia bigemina das cinco regiões fisiográficas do Brasil. A análise genética foi feita com amplificação aleatória de DNA polimórfico (RAPD), reação da polimerase em cadeia com seqüências de elementos extragênicos repetitivos palindrômicos (REP-PCR) e reação da polimerase em cadeia com seqüências repetitivas enterobacterianas intergênicas de consenso (ERIC-PCR) que apresentaram polimorfismo genético entre os isolados e geraram marcadores. No RAPD com os oligonucleotídeos iniciadores ILO872 e ILO876, foi possível detectar pelo menos um marcador por isolado de B. bigemina. A amplificação de fragmentos de DNA de B. bigemina por REP-PCR e ERIC-PCR demonstrou a presença dessas seqüências, descritas anteriormente somente em microrganismos bacterianos, nesse hemoprotozoário, e, pela primeira vez, foi verificado que podem ser utilizadas para análise genética de um protozoário. O ERIC-PCR foi mais discriminatório que o REP-PCR. O dendograma formado com o coeficiente de similaridade entre os isolados evidenciou dois agrupamentos e um subgrupo. Os isolados do Nordeste e Centro-Oeste demonstraram maior diversidade genética, enquanto que os isolados do Sudeste e Sul foram os mais próximos. A análise antigênica foi executada por meio de imunofluorescência indireta e Western blotting usando um painel de anticorpos monoclonais direcionados a epitopos B na membrana dos merozoítos, roptries e membrana de eritrócitos infectados. Os antígenos variáveis da superfície dos merozoítos, antígeno principal da superfície do merozoíto (APSM)-1 e APSM-2 apresentaram diversidade antigênica. Entretanto, os epítopos de células B nas roptries e nos eritrócitos infectados foram conservados em todos os isolados. Nesse estudo foi possível identificar antígenos variáveis e conservados que anteriormente haviam sido descritos como potenciais imunógenos. Considerando que um clone atenuado de Babesia utilizado para imunização selecionou populações capazes de evadir a resposta imune à vacina, torna-se necessário avaliar mais detalhadamente a imunidade cruzada existente entre os isolados brasileiros mais distantes geneticamente e realizar uma avaliação do grau de polimorfismo dos antígenos variáveis APSM-1 e APSM-2.

A molecular epidemiological study was performed with Babesia bigemina isolates from five geographical regions of Brazil. The genetic analysis was done with random amplification of polymorphic DNA (RAPD), repetitive extragenic palindromic elements-polymerase chain reaction (REP-PCR) and enterobacterial repetitive intergenic consensus sequences-polymerase chain reaction (ERIC-PCR) that showed genetic polymorphism between these isolates and generated fingerprinting. In RAPD, ILO872 and ILO876 primers were able to detect at least one fingerprinting for each B. bigemina isolate. The amplification of B. bigemina DNA fragments by REP-PCR and ERIC-PCR gave evidence for the presence in this haemoprotozoan of the sequences described previously in microorganisms of the bacterial kingdom. For the first time it was demonstrated that both techniques can be used for genetic analysis of a protozoan parasite, although the ERIC-PCR was more discriminatory than REP-PCR. The dendogram with similarity coefficient among isolates showed two clusters and one subcluster. The Northeastern and Mid-Western isolates showed the greatest genetic diversity, while the Southeastern and Southern isolates were the closest. The antigenic analysis was done through indirect fluorescent antibody technique and Western blotting using a panel of monoclonal antibodies directed against epitopes on the merozoite membrane surface, rhoptries and membrane of infected erythrocytes. As expected, the merozoite variable surface antigens, major surface antigen (MSA)-1 and MSA-2 showed antigenic diversity. However, B cell epitopes on rhoptries and infected erythrocytes were conserved among all isolates studied. In this study it was possible to identify variable and conserved antigens, which had already been described as potential immunogens. Considering that an attenuated Babesia clone used as immunogen selected populations capable of evading the immunity induced by this vaccine, it is necessary to evaluate more deeply the cross-protection conferred by genetically more distant Brazilian B. bigemina isolates and make an evaluation of the polymorphism degree of variable antigens such as MSA-1 and MSA-2.

Um teste rápido de conglutinação (TCR) com desempenho comparável a imunofluorencência indireta (IFI) foi desenvolvido para detectar anticorpos contra Babesia bigemina. O TCR-B.bigemina é um teste sorológico sensível, econômico e executável rapidamente; apropriado para condições de campo ou laboratórios com estrutura mínima. Este teste tem uma sensibilidade de 90,9% e especificidade de 97,6%, enquanto que a IFI apresentou para os mesmos parâmetros, respectivamente, 98,3% e 99,7%. Nas infecções experimentais a detecção de imunoglobulinas anti-B. bigemina pelo TCR foi aproximadamente a mesma da IFI. As reações cruzadas verificadas nos soros de bezerros experimentalmente infectados com Babesia bovis e Anaplasma marginale foram 1,8% e 1,2%, respectivamente. O antígeno preparado com eritrócitos não parasitados (antígeno negativo) apresentou 1,5%, 3,5% e 2,2% de reações positivas com os soros de animais infectados com B. bigemina, B. bovis e A. marginale. Entretanto, nenhum dos soros dos animais de áreas endêmicas para infecção de babésia resultaram em reações positivas com o antígeno negativo. Considerando estes resultados e o período de viabilidade do antígeno de TCR, acima de seis meses, possibilita o TCR-B. bigemina ser utilizado em levantamentos epidemiológicos e na avaliação das medidas de controle contra esta espécie de Babesia.

A rapid conglutination test (RCT) with performance comparable to the indirect fluorescent antibody technique (IFAT) was developed to detect antibodies against Babesia bigemina (B. bigemina-RCT). The B. bigemina-RCT is a sensitive, specific, economical, and rapidly performed serological test suitable for field application or minimally equipped laboratories. This test had a sensitivity of 90.9%, and specificity of 97.6%, compared to IFAT, which showed for the same parameters respectively, 98.3% and 99.7%. The early detection of anti- B. bigemina immunoglobulins by RCT in experimental infections was nearly parallel to that of IFAT. Cross reactions were observed with sera from calves experimentally infected with Babesia bovis (1.8%) and with Anaplasma marginale (1.2%). RCT antigen prepared with non parasitized erythrocytes (negative antigen) showed 1.5%, 3.5% and 2.2% of positive reactions with sera from animals experimentally infected with B. bigemina, B. bovis and A. marginale. However, none of the sera from animals of endemic areas for babesia infection resulted in positive reactions with the negative antigen. Considering these results and shelf life over six months, the B. bigemina-RCT could be used for epidemiological surveys and evaluation of control measures against this species of Babesia.

Uma prova de imunoadsorção enzimática (ELISA) para detecção de anticorpos contra Babesia bovis foi desenvolvida e avaliada em comparação à imunofluorescência indireta (IFI). A sensibilidade e especificidade do ELISA, determinadas pela análise de 100 soros positivos de bovinos infectados experimentalmente com B. bovis e 108 soros negativos colhidos de bovinos livres de infecção por este hemoparasito, foram de 98,0% e 98,1%, respectivamente. Os valores preditivos positivo e negativo foram, respectivamente, 98,0% e 98,1% e a precisão do teste foi de 98,1%. Não foram detectadas reações cruzadas com 80 soros de bezerros experimentalmente inoculados com Babesia bigemina. O ELISA foi comparado à IFI usando 110 soros de rebanhos de área de estabilidade endêmica e 168 soros de rebanhos de áreas de instabilidade endêmica. Em ambos os casos, houve concordância significativa (P=0,631 e 0,4725, respectivamente) entre os resultados demonstrados pelos dois testes. Em um estudo epidemiológico realizado com o ELISA na região do Pantanal de Mato Grosso do Sul, com 1.365 soros de bovinos, 83,9% foram positivos para anticorpos contra B. bovis, caracterizando a região estudada como endemicamente estável.

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for antibodies to Babesia bovis was developed and evaluated in comparison with the indirect fluorescent antibody test (IFAT). The ELISA sensitivity and specificity, estimated with 100 positive sera from cattle experimentally infected with B. bovis and 108 negative sera collected from B. bovis-free herds, were 98.0% and 98.1%, respectively. Positive and negative predictive values were, respectively, 98.0% and 98.1%, and precision was 98.1%. No cross-reactions were detected with 80 sera from calves experimentally inoculated with Babesia bigemina. The ELISA was compared with IFAT using 110 cattle sera from an enzootically stable area and with 168 cattle sera from an enzootically unstable area. In both cases, there was a significant agreement between results of both tests (P=0.631 and 0.4725, respectively). In an epidemiological study performed with ELISA in the Pantanal region of the State of Mato Grosso do Sul with 1,365 cattle sera, 83.9% were positive for antibodies against B. bovis, characterizing this region as enzootically stable.

Um ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA) indireto, foi desenvolvido para detecção de anticorpos contra Anaplasma marginale, utilizando um antígeno parcialmente solúvel preparado a partir de corpúsculos iniciais semipurificados de eritrócitos com 80,0% de parasitemia. Esta técnica utilizou a fosfatase alcalina e o p-nitrofenil fosfato como indicadores de reação. A alta sensibilidade (100,0%) foi comprovada com soros de 100 bezerros experimentalmente infectados com A. marginale. Todos estes animais soroconverteram antes ou ao mesmo tempo que a primeira parasitemia foi detectada, ou mesmo quando não se obteve parasitemia. A elevada especificidade (94,0%) foi confirmada pela baixa percentagem de reações cruzadas com soros de animais infectados experimentalmente com Babesia bigemina e Babesia bovis (1,4 e 6,6%, respectivamente). Os desempenhos do ELISA e da imunofluorescência indireta (IFI) com 324 soros de uma área de estabilidade enzoótica não diferiram estatisticamente (P>0,05), uma vez que o primeiro teste detectou 96,9% de reações positivas, enquanto o segundo, 97,2%. A vantagem deste ELISA foi um menor tempo de execução do que outros desenvolvidos até o momento, permitindo a análise de um maior número de soros.

A rapid indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed for measuring antibodies against Anaplasma marginale using a partially soluble antigen prepared from semi-purified initial bodies from erythrocytes with 80.0% of rickettsiaemia. This technique utilized alkaline phosphatase and p-nitrophenyl phosphate as reaction indicators. The high sensitivity (100.0%) was confirmed with sera from 100 calves experimentally-infected with A. marginale. All of these animals showed seroconversion before or at the same time of the first rickettsiaemia or even when it was not detected. Also the elevated specificity (94.0%) was confirmed by the low percentage of cross-reactions with sera from animals experimentally-infected with Babesia bigemina and Babesia bovis (1.4 and 6.6%, respectively). Performances of ELISA and indirect fluorescent antibody test (IFAT) with 324 sera from enzootically stable area did not show statistical difference (P>0.05), since the former showed 96.9% and the latter 97.2% of positive reactions. The advantage of this ELISA is a shorter execution time than others developed until now, allowing more samples to be analyzed.